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血清學(xué)檢查(參考件)

B1　血清學(xué)檢查有助于流行病學(xué)追溯診斷，檢查抗體的成分為抗菌抗體。為進(jìn)行血清學(xué)診斷，需要采取病人的雙份血清，在發(fā)病第1～3天采第一份血清，第15～20天采第二份血清。檢查血清中抗菌抗體常用凝集試驗(yàn)和殺弧菌試驗(yàn)，殺弧菌試驗(yàn)比凝集試驗(yàn)敏感。

B2　試管凝集試驗(yàn)：用生理鹽水對(duì)倍連續(xù)稀釋待檢血清，每管含稀釋血清0.5mL。將標(biāo)準(zhǔn)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的16～18h培養(yǎng)物用0.2％福爾馬林生理鹽水制成約含18億菌/mL(相當(dāng)于細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管濃度)的懸液，每稀釋血清管加0.5mL；另將菌懸液加入0.5mL生理鹽水中作對(duì)照。搖勻，置37C3h觀察初步結(jié)果，再放冰箱

(4℃)或室溫過夜，觀察最后結(jié)果。生理鹽水對(duì)照不出現(xiàn)自然凝集，能使菌凝于管底成傘狀，上清半透明者判為＋＋，以能使菌呈＋＋凝集的血清最高稀釋度判為血清凝集效價(jià)。第二份血清效價(jià)比第一份血清增長(zhǎng)4倍或以上者有診斷意義。

B3　殺弧菌抗體檢測(cè)：可采用改良微量法，檢測(cè)程序如下：

a.　2，3，5－氯化三苯四氮唑溶液(TTC)的配制：用無菌蒸餾水配制0.5％(W/V)溶液，加熱溶解，置滅菌棕色瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?

b.　補(bǔ)體指示菌混懸液制備：選取標(biāo)準(zhǔn)01群及0139群霍亂弧菌為指示菌，分別連續(xù)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分離2次，選取光滑型菌落2～3個(gè)，挑取小量接種于5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)6h，取0.1mL轉(zhuǎn)種于5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)2h，用分光光度計(jì)測(cè)定492nm吸光度(OD)值，調(diào)整OD值至0.1為原液。將原液作1∶50稀釋后與1∶10補(bǔ)體等量混合，即為補(bǔ)體指示菌混懸液。

c.　待檢血清稀釋：于經(jīng)洗滌處理、無水乙醇浸泡5min和紫外燈照射滅菌1h的微量培養(yǎng)板或4×10孔聚苯乙烯塑料板用微量加液滴管每孔加入一滴(0.025mL)滅菌磷酸鹽緩沖鹽水PBS或生理鹽水，再將待測(cè)滅活血清一滴(0.025mL)加入每排的第1孔，自第1孔開始作連續(xù)對(duì)倍稀釋至第10孔。

d.　加補(bǔ)體指示菌懸液：于每孔稀釋血清加入補(bǔ)體指示菌懸液一滴，加蓋，在微型振蕩器上振蕩1～2min，置37℃水浴箱孵育30min。

e.　加TTC營(yíng)養(yǎng)肉湯：每孔加入含0.01％TTC的營(yíng)養(yǎng)肉湯0.15mL(2大滴)，混勻后，繼續(xù)置37℃水浴箱孵育4h。

f.　觀察結(jié)果：以孔內(nèi)無顏色變化的血清最高稀釋度為被檢測(cè)標(biāo)本的殺弧菌抗體滴度，第二份血清效價(jià)比第一份血清升高8倍或以上者有診斷意義。